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Kit TRIzol® Inoltre RNA Purification introduzione Il più RNA Purification Kit TRIzol® fornisce un metodo semplice, affidabile e rapida per isolare RNA totale di alta qualità da una vasta gamma di campioni, tra cui le cellule animali e vegetali e tessuti, batteri e lieviti. Il kit utilizza la capacità lisi forte di TRIzol® reagente, seguita da una comoda e risparmio di tempo protocollo di purificazione di silice-cartuccia dal kit PureLink ™ RNA Mini, purificare RNA totale ultrapura entro un'ora, anche da campioni difficili quali tessuto fibroso . TRIzol® reagente è una soluzione monofasica di fenolo, guanidina isotiocianato, e altri componenti proprietari che facilitano l'isolamento di una varietà di specie di RNA di grandi o piccole dimensioni molecolari. TRIzol® reagente mantiene l'integrità dell'RNA, mentre interrompendo cellule e dissolvendo componenti cellulari, e fornisce anche una inibizione immediata e altamente efficace di attività RNasi durante l'omogeneizzazione del campione o lisi. La combinazione di TRIzol® reagente seguita da silice-cartuccia purificazione dell'RNA è il metodo di purificazione dell'RNA consigliato nell'industria espressione genica. L'RNA Purification Kit TRIzol® Inoltre fornisce i reagenti e un protocollo ottimizzato per purificare l'RNA totale per studi di espressione genica utilizzando un metodo consigliato settore. Per isolare l'RNA purificato dal campione utilizzando il kit TRIzol® Inoltre RNA Purificazione, il campione viene prima lisato con TRIzol® reagente, secondo il protocollo di preparazione lisato fornito. L'aggiunta di cloroformio per campione, seguita da centrifugazione si separa la soluzione in una fase acquosa superiore contenente RNA e una fase organica contenente fenolo inferiore. La fase acquosa superiore viene trasferito in una nuova provetta, seguito da etanolo aggiunta e centrifugazione. Il campione viene poi trasferito alla cartuccia Kit Spin PureLink ™ RNA Mini contenente una membrana a base di silice chiaro che l'RNA si lega durante la purificazione. L'RNA viene lavato per rimuovere i contaminanti e RNA totale purificato viene quindi eluita in RNase-Free Water (Tampone Tris, pH 7.5 può anche essere usato) ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni a valle compresi studi di espressione genica sensibili come microarray analisi o real time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR). PureLink ™ RNA Mini Kit Specifiche Cartuccia capacità legante: 1 mg di acido nucleico cartuccia Capacità serbatoio: 700 ml di lavaggio del tubo Capacità: 2,0 ml Centrifuga Compatibilità: in grado di centrifugazione & gt; 12.000 × g eluizione Volume: 30 ml-3 × 100 ml (3 eluizioni sequenziali con 100 ml ciascuna) Questa pagina fornisce istruzioni per purificare l'RNA totale da campioni utilizzando TRIzol® reagente per preparare lisati e dopo la separazione di fase, l'RNA è purificato utilizzando il kit PureLink ™ RNA Mini. Se si desidera utilizzare altri protocolli per la purificazione di RNA, fare riferimento al manuale TRIzol® reagente o il manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini. L'RNA Purification Kit TRIzol® Inoltre utilizza la TRIzol® reagente per la lisi del campione. Il Lysis Buffer incluso ingegno il kit non viene utilizzato in questo protocollo. Tuttavia, se si desidera preparare campioni utilizzando il tampone di lisi, consultare il manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini. Se le applicazioni a valle richiedono RNA totale priva di DNA, i protocolli per il trattamento in colonna PureLink ™ DNasi durante la purificazione di RNA o dopo la depurazione sono forniti nel manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini. TRIzol® reagente contiene fenolo (tossici e corrosivi) e guanidina isotiocianato (un irritante), e può essere un rischio per la salute se non gestita correttamente. Evitare il contatto diretto con TRIzol® reagente, come il contatto diretto della pelle, occhi, o del tratto respiratorio con TRIzol® reagente può provocare ustioni chimiche per l'area esposta. Quando si lavora con TRIzol® reagente, lavorare sempre in una cappa aspirante. Fare riferimento al foglietto TRIzol® reagente per maggiori dettagli. Contattate il vostro Heath Ambiente e Sicurezza (EH & amp; S) Dipartimento per le appropriate linee guida di lavoro e di smaltimento. Sia Lysis Buffer e tampone di lavaggio I contengono isotiocianato di guanidina (irritante). Questo prodotto chimico è nocivo a contatto con la pelle, o quando viene inalato o ingerito. Non aggiungere soluzioni di candeggina o acidi direttamente a soluzioni o rifiuti la preparazione del campione che contiene guanidinio isotiocianato, come si formano composti reattivi e gas tossici. Le soluzioni contenenti etanolo sono considerati infiammabili. Utilizzare le opportune precauzioni quando si utilizza questa sostanza chimica. Per la vostra protezione, indossare sempre un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi quando si maneggiano questi prodotti chimici. Smaltire i buffer e prodotti chimici in appositi contenitori per rifiuti. L'RNA massima capacità della cartuccia Kit Spin PureLink ™ RNA Mini legame è ~ 1 mg. Se si elaborano i campioni che contengono più di 1 mg di RNA totale, dividere i campioni in aliquote in modo tale che ciascuna aliquota contiene & lt; 1 mg di RNA totale per ogni cartuccia Spin utilizzato. Usa e getta, confezionati singolarmente, articoli in plastica sterile e sterile, puntali RNasi-free e getta e tubi. Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei reagenti e campioni di RNA per evitare la contaminazione RNasi dalla superficie della pelle; cambiare i guanti di frequente, in particolare per quanto il protocollo progredisce da estratti grezzi di materiale più purificato. Usare sempre corrette tecniche asettiche microbiologiche quando si lavora con l'RNA. Utilizzare tubi monouso polipropilene trasparente quando si lavora con & lt; 2 ml volumi di TRIzol® reagente. Per i volumi più grandi, utilizzare vetro (Corex) o tubi di polipropilene, e garantire che i tubi possono sopportare centrifugazione a 12,000 × g con TRIzol® reagente e cloroformio. Non utilizzare i tubi che fuoriescono o crack. Usa RNase AWAY® reagente (cat. N. 10.328-011) per rimuovere la contaminazione RNasi dalle superfici di lavoro e gli articoli non usa e getta, come centrifughe e pipette usate durante la purificazione. Materiale necessario materiale di partenza (tessuti freschi o congelati, o cellule) TRIzol & reg; Reattivo e PureLink ™ RNA Mini Kit (in dotazione) Cloroformio o 4 Bromoanisole 96-100% di etanolo e 70% di etanolo (in acqua RNase-free) Microcentrifuga grado di centrifugazione a 12.000 & volte; g Omogeneizzatore (Cat. No: 12.183-026) o rotore-statore omogeneizzatore Provette da 1,5 ml RNasi-free e punte per pipette RNase-free protocolli Preparare il tampone di lavaggio II con etanolo Prima di iniziare la lisi, aggiungere 60 ml di 96-100% di etanolo al tampone di lavaggio II. Selezionare la casella sull'etichetta Tampone di Lavaggio II per indicare che l'etanolo è stato aggiunto. Conservare Wash Buffer II con etanolo a temperatura ambiente. Preparazione del lisato con TRIzol® reagente Utilizzare TRIzol® reagente per preparare lisati da vari tipi di campioni come descritto di seguito. I tessuti omogeneizzare campioni di tessuto in 1 ml TRIzol® reagente per 50-100 mg di tessuto usando un omogeneizzatore tessuto o rotore-statore. Il volume del campione non deve superare il 10% del volume di TRIzol® reagente utilizzato per omogeneizzazione. Lisare le cellule direttamente in un piatto di cultura con l'aggiunta di 1 ml di reagente TRIzol® al piatto e passando il lisato cellulare più volte attraverso una punta della pipetta. La quantità di reagente TRIzol® richiesto si basa sulla zona coltura piatto (1 m per 10 cm2) e non sul numero di cellule presenti. cellule in sospensione Celle di raccolta e le cellule pellet per centrifugazione. Usare 1 ml di TRIzol® reagente per 5-10 × 10 6 animale, vegetale, o cellule di lievito, o per 1 × 10 7 cellule batteriche. Lisare le cellule ripetitivo pipettando su e giù. Non lavare le cellule prima di aggiungere TRIzol® reagente per evitare la degradazione dell'mRNA. Turbativa di alcune cellule di lievito e batteriche possono richiedere un omogeneizzatore. A seguito di cellula o tessuto lisi (sopra), effettuare le seguenti operazioni per isolare l'RNA. Incubare il lisato con TRIzol® Reagent (sopra) a temperatura ambiente per 5 minuti per permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteina. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio o 50 ml 4 Bromoanisole per 1 ml TRIzol® reagente utilizzato. Agitare la provetta vigorosamente a mano per 15 secondi. Nota: vortex può aumentare la contaminazione del DNA del campione di RNA. Evitare vortex se l'applicazione a valle è sensibile alla presenza di DNA o di eseguire un passo DNasi-digestione durante la purificazione RNA o dopo la purificazione, fare riferimento al manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini. Incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Nota: Dopo la centrifugazione, la miscela separa int a, rosso fase inferiore di fenolo-cloroformio, una interfase, e una fase acquosa superiore incolore che contiene l'RNA. Il volume della fase acquosa superiore è 400 ml di fase incolore, superiore contenente l'RNA in una nuova provetta RNasi-free. Aggiungere un uguale volume di etanolo al 70% per ottenere una concentrazione di etanolo finale del 35%. Mescolare bene nel vortex. Capovolgere il tubo per disperdere l'eventuale precipitato visibile che potrebbe formare dopo l'aggiunta di etanolo. Procedere alla rilegatura, lavaggio e eluizione, qui di seguito. Binding, lavaggio e eluizione Seguire i passaggi di seguito per legare, lavare, ed eluire RNA da campione. Trasferire fino a 700 ml di campione (preparato come descritto sopra) per una cartuccia Spin (con un tubo di raccolta). Centrifugare a 12.000 g per 15 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through e reinserire la cartuccia Spin nello stesso tubo di raccolta. Ripetere i passaggi 1-2 fino a quando l'intero campione è stato elaborato. Opzionale: Se l'applicazione a valle richiede RNA totale priva di DNA, procedere alla On-Column PureLink trattamento DNasi ™ Durante RNA Purification in questo momento (vedi il manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini per i dettagli). Aggiungi 700 ml tampone di lavaggio I della cartuccia Spin. Centrifugare a 12.000 g per 15 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta. Inserire la cartuccia Spin in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio II con etanolo (pagina precedente) per la cartuccia Spin. Centrifugare a 12.000 g per 15 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through, e reinserire la cartuccia Spin nello stesso tubo di raccolta. Ripetere i passaggi 5-6 una volta. Centrifugare la cartuccia Spin e Collection metropolitana a 12,000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente per asciugare la membrana con RNA allegata. Eliminare il Collection tube e inserire la cartuccia Spin in un tubo di recupero. Aggiungere 30 ml-3 × 100 ml (3 eluizioni sequenziali con 100 ml ciascuna) RNase-Free Water al centro della cartuccia Spin (fare riferimento al manuale di RNA Mini Kit PureLink ™ per ulteriori dettagli. Incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Centrifugare la cartuccia Spin con il tubo di recupero per 2 minuti a ≥12,000 × g a temperatura ambiente. Nota: Se si esegue eluizioni sequenziali, raccogliere tutti eluisce nella stessa provetta. Conservazione e valle applicazioni di RNA purificato Conservare il RNA purificato su ghiaccio se si utilizzerà l'RNA entro poche ore. Per la conservazione a lungo termine, conservare il RNA purificato a -80 ° C. È possibile utilizzare l'RNA totale purificato per qRT-PCR, Northern blotting, saggi di protezione nucleasi, l'amplificazione di RNA per l'analisi di microarray, o qualsiasi applicazione a valle desiderata. Se è necessario RNA altamente puro senza contaminazioni di DNA genomico, eseguire il trattamento DNasi I dopo la purificazione (consultare il manuale di Kit PureLink ™ RNA Mini per i dettagli). È possibile determinare la qualità e la quantità del RNA purificato mediante assorbimento UV a 260 nm o con la Quant-iT ™ RNA Assay Kit (Cat. No. Q33140). Offriamo una vasta selezione di prodotti per RT-PCR, qRT-PCR, analisi di microarray, e trascrizione inversa. Per ulteriori informazioni, visitate il nostro sito o contattare il supporto tecnico. Risoluzione dei problemi
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